产品货号：
WH0050
中文名称：
通用型总RNA提取试剂（含指示剂)
英文名称：
Total RNA Extraction Reagent
产品规格：
100ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是在WH0065的基础上最新推出的含有指示剂的总RNA提取试剂。该产品具有更强的裂解能力，更高的灵敏度，可从病毒、细菌、真菌、动物和植物细胞、组织、体液等样本中提取总RNA的试剂。本制品能够充分裂解样本、溶解细胞内含物，并有效抑制RNase活性，高效提取样本中的总RNA，同时保证了提取过程中RNA的完整性。该试剂对样本起始量无限制，一个小时内即可完成反应。
产品特点：
·提取质量高：可在1h内提取得率高、纯度高、完整性好的总RNA
·添加指示剂：添加了特殊指示剂，离心分层后下层为粉红色，便于吸取上清
·灵敏度高：对病毒等微量样本的提取具有更高的提取效率
·样品处理量灵活：既可用于少量样品（50-100mg组织、5×106细胞）的总RNA提取，也可用于大量样品（≥ 1g组织或≥ 107细胞）的总RNA提取。
下游应用：
本制品提取的总RNA最大限度的消除了DNA和蛋白等杂质的污染，可直接用于Northern Blot、DotBlot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析、cDNA文库构建、RT-PCR、荧光定量PCR、高通量测序等各种分子生物学实验。
不同组织或细胞RNA提取预期得率：
保存条件：2–8℃避光保存12个月。
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在本制品中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用RNase-Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V，放置过夜，高压灭菌）。
注意事项：
1．匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月。
2．RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一个星期以上或-20℃一年。
RNA提取操作步骤：
自备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O、75%乙醇（用RNase-Free ddH2O配制）
1．样品处理
a．植物组织：以叶片RNA提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在本制品中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 min。大约100mg叶片使用1ml本制品。
b．动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50 mg组织加入1ml本制品，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过本制品体积的10%。
c．单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107）：可直接在培养容器中裂解（容器体积不超过10cm2）,或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。
1)直接裂解法：直接在培养板中加入本制品裂解细胞，每10cm2面积加入1ml本制品。用取样器吹打几次。注意：本制品加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果本制品加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
2)胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
d．细胞悬液：离心取细胞。每5×106～1×107动物细胞和植物细胞加入1ml本制品。加入本制品前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
e．血液与病毒液处理：直接取新鲜的血液或病毒液，加入3倍体积本制品（推荐0.2 ml全血或病毒液加入0.6 ml本制品)，充分振荡混匀。
2．将匀浆样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，取上清。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4．每使用1ml本制品加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。
注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min
5．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心15 min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新的离心管中。（如果要分离DNA和蛋白质，可向我公司索取提取方法）。
6．在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
7．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8．加入1ml 75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制）洗涤沉淀。每使用1ml本制品至少用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9．4℃ 10000rpm （~9,391×g)离心5 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10．室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
常见问题解答：
低得率：
A．样品裂解或匀浆处理不彻底。
B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。
B．样品匀浆时加的试剂量太少。
C．匀浆后样品未在室温放置5 min。
D．水相中混有有机相。
E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A．组织取出后没有马上处理或冷冻。
B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5℃– -20℃，未在-60℃– -70℃保存。
C．细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
D．溶液或离心管未经RNase去除处理。
E．电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。
DNA污染：
A．样品匀浆时加的试剂体积太少。
B．样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污染：
A．样品中蛋白、多糖含量高。
B．样品量太大。
C．水相中混有有机相。
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产品特点：
·提取质量高：可在1h内提取得率高、纯度高、完整性好的总RNA
·添加指示剂：添加了特殊指示剂，离心分层后下层为粉红色，便于吸取上清
·灵敏度高：对病毒等微量样本的提取具有更高的提取效率
·样品处理量灵活：既可用于少量样品（50-100mg组织、5×106细胞）的总RNA提取，也可用于大量样品（≥ 1g组织或≥ 107细胞）的总RNA提取。
下游应用：
本制品提取的总RNA最大限度的消除了DNA和蛋白等杂质的污染，可直接用于Northern Blot、DotBlot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析、cDNA文库构建、RT-PCR、荧光定量PCR、高通量测序等各种分子生物学实验。
不同组织或细胞RNA提取预期得率：
| 材料 | RNA得率 |
| 植物叶片 | 100–500μg/g叶片 |
| 动物组织 | 6-10 μg/mg肝脏组织 |
| 动植物培养细胞 | 5–10 μg/106细胞 |
| 血液 | 3–5 μg/ml人类全血 |
保存条件：2–8℃避光保存12个月。
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在本制品中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用RNase-Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V，放置过夜，高压灭菌）。
注意事项：
1．匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月。
2．RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一个星期以上或-20℃一年。
RNA提取操作步骤：
自备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O、75%乙醇（用RNase-Free ddH2O配制）
1．样品处理
a．植物组织：以叶片RNA提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在本制品中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 min。大约100mg叶片使用1ml本制品。
b．动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50 mg组织加入1ml本制品，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过本制品体积的10%。
c．单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107）：可直接在培养容器中裂解（容器体积不超过10cm2）,或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。
1)直接裂解法：直接在培养板中加入本制品裂解细胞，每10cm2面积加入1ml本制品。用取样器吹打几次。注意：本制品加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果本制品加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
2)胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
d．细胞悬液：离心取细胞。每5×106～1×107动物细胞和植物细胞加入1ml本制品。加入本制品前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
e．血液与病毒液处理：直接取新鲜的血液或病毒液，加入3倍体积本制品（推荐0.2 ml全血或病毒液加入0.6 ml本制品)，充分振荡混匀。
2．将匀浆样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，取上清。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4．每使用1ml本制品加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。
注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min
5．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心15 min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新的离心管中。（如果要分离DNA和蛋白质，可向我公司索取提取方法）。
6．在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
7．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8．加入1ml 75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制）洗涤沉淀。每使用1ml本制品至少用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9．4℃ 10000rpm （~9,391×g)离心5 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10．室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
常见问题解答：
低得率：
A．样品裂解或匀浆处理不彻底。
B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。
B．样品匀浆时加的试剂量太少。
C．匀浆后样品未在室温放置5 min。
D．水相中混有有机相。
E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A．组织取出后没有马上处理或冷冻。
B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5℃– -20℃，未在-60℃– -70℃保存。
C．细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
D．溶液或离心管未经RNase去除处理。
E．电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。
DNA污染：
A．样品匀浆时加的试剂体积太少。
B．样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污染：
A．样品中蛋白、多糖含量高。
B．样品量太大。
C．水相中混有有机相。
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